Nota: alcune identità sono nascoste sotto spoiler; si sconsiglia di leggere nella tag spoiler prima di giocare se non si vuole entrare a contatto con spoiler.
Comandante Shepard: si può importare il personaggio dal primo gioco o crearlo da zero; viene data comunque la possibilità di cambiargli il volto, si può importare il personaggio tramite codice prefissati da amici o da modelli creati e condivisi su Internet.
Jacob Taylor (Cerberus Operative): umano, membro di Cerberus al servizio dell'Illusive Man.
Miranda Lawson (Cerberus Officer): umana, membro di Cerberus al servizio dell'Illusive Man. Modellata dall'attrice Yvonne Strahovski.
Archangel:
The Professor / Mordin Solus (Salarian Scientist): salarian maschio, eccentrico scienziato impegnato su Omega.
* The Veteran / Zaeed Massani (Mercenary Veteran): umano maschio, mercenario esperto e di mentalità chiusa [* disponibile solo tramite Cerberus Network]
The Convict / Jack (Subject Zero): umana, carcerata su Purgatory.
Krogan:
Tali'Zorah nar Rayya (Quarian Machinist): quarian femmina, ha finalmente completato il pellegrinaggio.
Justicar:
Assassin / Thane Krios (Drell Assassin): drell maschio, reclutabiel su Ilium.
Legion:
* Kasumi Goto (Master Thief): umana, ladra esperta [* acquistabile tramite DLC]
* Liara T'Soni (Asari Scientist): asari, risiede a Therum [* disponibile solo tramite il DLC Lair of the Shadow Broker; non utilizzabile fuori dalla missione]
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